近日，医学影像学院微流控技术与先进材料科研团队在国际分析化学领域权威期刊《Analytical Chemistry》发表了题为“Cascade-Amplified Microfluidic Detection of Tumor Biomarkers via Metal-DNA Nanospheres Activating CRISPR-Cas12a Assay”的研究论文。医学影像学院医学工程学教研室高彦峰为论文共同通讯作者，皖南医科大学为共同通讯单位。
肿瘤标志物的高灵敏检测对于肿瘤早期筛查和精准诊断具有重要意义。目前，酶联免疫吸附测定（ELISA）和电化学发光（ECL）等方法已广泛应用于临床检测，但仍存在对仪器设备依赖程度较高、操作流程相对复杂以及超低丰度标志物检测能力受限等问题。近年来，CRISPR-Cas系统凭借优异的核酸识别能力和信号放大性能，为高灵敏生物检测提供了新的技术手段。然而，CRISPR系统天然以核酸为识别和放大对象，当其用于蛋白质标志物检测时，如何将蛋白质识别事件高效转换为可被CRISPR系统识别的核酸信号，成为进一步提高检测灵敏度的关键环节。
针对上述问题，研究团队微调传统纳米载体的设计思路，创新性地构建了一种基于铁配位DNA纳米球（FDNSs）、CRISPR-Cas12a级联信号放大与微流控芯片检测相结合的肿瘤标志物检测平台（FACC）。不同于传统利用金纳米颗粒、金属有机框架等无机材料作为载体，再在其表面修饰DNA条形码的信号转换策略，该研究通过Fe离子与DNA之间的配位组装，构建以DNA为主要结构单元的纳米球，将FDNSs作为具有高DNA负载能力的“DNA储库”，从而显著提升单次蛋白识别事件所对应的核酸信号输出能力。
为提升平台整体检测灵敏度，在具体检测过程中，研究团队首先利用抗体修饰的磁性纳米颗粒捕获目标肿瘤标志物，并进一步与抗体修饰的FDNSs形成夹心免疫复合物，实现对目标蛋白的特异性识别。随后，通过Bicine与Fe离子的配位作用诱导FDNSs快速解离，使其中大量DNA条形码集中释放。释放的DNA进一步激活CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性，产生显著增强的荧光信号。通过这一过程，实现了从“蛋白质识别àDNA条形码释放àCRISPR-Cas12a信号放大”的级联信号转换，有效解决传统无机纳米载体DNA负载量有限导致信号转换效率不足的问题。
为提升检测体系集成化，加强平台的便携检测能力，研究团队结合自身在微流控领域的技术积累，将FDNSs介导的蛋白核酸信号转换过程与CRISPR-Cas12a检测体系集成于微流控芯片中，构建了FACC微流控检测平台。该平台利用微流控体系样本消耗少、反应集成度高和便于便携化检测等优势，实现肿瘤标志物识别、级联信号放大与荧光检测的有机结合，为复杂生物样本中低丰度蛋白标志物的高灵敏分析提供了新的技术路径。
该检测平台在后续实验中优异的分析性能得到进一步验证。研究人员以前列腺特异性抗原（PSA）和癌胚抗原（CEA）两种临床常用肿瘤标志物作为模型开展定量检测。实验结果显示，该体系对PSA和CEA均表现出良好的浓度响应关系，检测限分别达到0.028 fg/mL和0.0265 fg/mL。同时，通过对牛血清白蛋白、葡萄糖、氨基酸及其他潜在干扰物进行测试，结果表明该平台具有良好的检测特异性和抗干扰能力，验证了FDNSs介导级联信号放大策略在超低丰度蛋白标志物检测中的应用潜力。
在此基础上，研究团队进一步采用32份临床血清样本对FACC平台的实际检测性能进行了验证，并将检测结果与临床常用的电化学发光检测方法进行比较。结果显示，该方法用于临床样本检测时的ROC曲线下面积（AUC）达到0.9896，灵敏度为90%，特异度达到100%。FACC检测结果与电化学发光方法具有较高的一致性，Pearson相关系数达到0.989，组内相关系数（ICC）达到0.99。上述结果表明，该平台在实现超高分析灵敏度的同时，对实际临床样本同样具有良好的检测准确性和可靠性。
该研究将金属-DNA配位纳米材料、免疫识别、CRISPR-Cas12a级联信号放大及微流控芯片技术有机融合，构建了“蛋白识别à核酸信号转换àCRISPR放大à芯片检测”一体化分析体系。研究通过以DNA自身构筑高容量信号储库的方式，突破传统无机纳米载体表面DNA负载能力受限的问题，为提高蛋白质向核酸信号转换效率提供了新的材料设计思路。同时，微流控技术的引入进一步提升了检测体系的集成化和便携化潜力，为肿瘤标志物早期筛查、临床辅助诊断以及即时检测提供了新的技术基础，也体现了我校在微流控、生物传感与先进材料交叉融合领域的持续创新能力。(高彦峰/文、图）
铁配位DNA纳米球介导的CRISPR-Cas12a级联放大微流控肿瘤标志物检测策略示意图
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c03578
